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如何選擇正確內參抗體,這些你需知道
發表者:北京博奧森生物      發表時間:2020-3-13



內參抗體可用于評價蛋白質免疫印跡法(Western Blot)的效率,比較凝膠中每孔的蛋白上樣量。此類對照可幫助確定樣品間表達水平的差異,以判斷是由細胞裂解物的實際蛋白水平導致,還是由上樣量的差異導致。

內參抗體在目標蛋白的免疫熒光研究中,也可以作為共染的陽性對照。內參抗體分為未標記型和標記型,標記物包括生物素、HRP、FITC、PE、Cy染料和Alexa Fluor染料。



內參抗體種類很多,比如β-actin、β-tubunlin、GAPDH、Vinculin、Lamin B、PCNA等,其選擇常使我們困惑。本文將簡單介紹選擇內參抗體應遵循的五項原則:

一、樣本種屬來源:

首先要考慮實驗樣本來源于什么物種。

1. 哺乳動物的組織或者細胞樣本,通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,Katpase等。

2. 植物來源實驗樣本,則可以選擇plant actin、Rubisco等。

3. 其他來源樣本研究較少,所以就應該參照文獻報導,選擇合適的蛋白作為內參。

二、分子量大?。?/span>

選擇內參抗體時,應該考慮目的蛋白分子量的大小,一般保證目的蛋白與內參蛋白分子量相差5KD以上。例如,目的蛋白分子量為40KD,此時不適宜選擇β-actin、GAPDH作為內參,可以考慮選擇α-Tubulin或者β-tubulin作為內參。

三、表達水平

選擇的內參蛋白需要在待測樣本中是高表達的。常用的內參蛋白是由管家基因高表達的,是細胞發育和維持細胞活力所必須的。例如,細胞核的內參蛋白 PCNA,在 DNA S 期表達,因此對于非增殖細胞不推薦使用。

四、目的蛋白表達定位

適用范圍 名稱 貨號 分子量
胞質
beta I Tubulin bsm-33041M 50kDa
beta Tubulin bsm-33034M 50kDa
bs-4511R 50kDa
beta Actin bsm-33036M 42kDa
bs-0061R 42kDa
GAPDH bs-10900R 36kDa
bs-2188R 36kDa
bsm-0978M 36kDa
bsm-33033M 36kDa

alpha Tubunlin

bs-20496R 50kDa
bs-0159R 50kDa
Vinculin bsm-54148R 117kDa
Cyclophilin B bsm-33228M 20kDa
bsm-52473R 20kDa
核蛋白
Histone H3 bs-0349R 15-17kDa
bsm-33042M 15-17kDa
Lamin B bs-23709R 66-72kDa
bsm-33040M 66-72kDa
PCNA bs-0754R 36kDa
bsm-52347R 36kDa
bsm-33035M 36kDa
TATA binding protein TBP/TBP bsm-33227M 38kDa
YY1 bsm-52349R 46kDa
HDAC1 bs-1414R 65kDa
bsm-52080R 65kDa
膜蛋白
ATPase Na+/ K+ beta 2 (ATPB2) bs-1152R 33kDa
bs-23414R 33kDa
質膜
ATP1A1 (Sodium Potassium ATPase) bs-4255R 97-110kDa
bsm-52485R 97-110kDa
線粒體
COX4 bsm-33037M 17kDa
VDAC1 bs-1461R 32kDa
bsm-52251R 32kDa
全血/血漿/血清
Transferrin bsm-33243M 77kDa
bs-2052R 77kDa
Albumin bsm-0945M 66kDa
bs-0945R 66kDa
細胞增殖標志物
BrdU bsm-0917M 化合物
bs-0489R 化合物
植物內參 Plant actin bsm-33128M 42kDa
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五、表達因素

選擇蛋白表達不受實驗變量影響的內參。

在做多組織多細胞樣本對比表達量時,最好選用 GAPDH作為內參,因為GAPDH是代謝類蛋白,在活組織中表達比較恒定。而β-Actin和β-Tubulin是結構蛋白,不同組織的細胞結構會有差異性;

而在某些細胞中,由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增高,不適合做內參;

涉及細胞增殖的相關試驗中,c-Jun由于自身表達變化不適合做內參;

凋亡實驗時,TBP、Lamin等也不適合作為內參;

做誘導后樣本或檢測磷酸化等修飾性抗體時,應選擇結構蛋白作為內參,如β-Actin 和β-Tubulin;

做各種分泌液樣本的時候,如血漿、乳汁、組織液等,由于沒有完整的細胞結構,只能選擇一些分泌蛋白作為內參。



內參抗體驗證示例











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